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Western Blot實驗應該如何選擇合適的抗體

發布時間:2022-08-24   點擊次數:31次

Western Blot實驗應該如何選擇合適的抗體

很多老師在做 實驗的時候,不知道應該如何來選擇正確的一抗和二抗,信帆生物為您答疑解惑。上海信帆生物專業提供 Western Blot 實驗檢測服務,PCR 實驗檢測服務,免疫組化,免疫熒光檢測服務,放射免疫檢測服務,為您的實驗助力!



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首先要看你做的是什么物種,根據物種特異與否選擇單抗或者多抗。

一般小鼠、大鼠等常用模式動物可以選擇鼠源單克隆抗體,其特異性較好,如果是不常見動物模型,建議選擇多克隆抗體。

當然,單抗或者多抗也不是一定的,需要去查詢抗原決定簇的歸屬,一般是找到抗體所對應的特異氨基酸序列,到數據庫與你要做的物種進行比對,如果匹配度較高(85%以上),則建議購買嘗試。

二抗的選擇相對就簡單了,根據一抗的種屬特異性進行二抗選擇即可。

如一抗選用鼠源(Mouse)抗體,則二抗選用抗小鼠抗體即可(e.g. Goat Anti-Mouse),注意二抗的反應特性(熒光、HRP偶聯等)

其次就是多查閱文獻,查看和 Western Blot 實驗相關的 SCI 文獻,查看要做的種屬和指標關聯度高的文獻。

信帆生物帶您了解:Western Blot 實驗應該如何選擇一抗和二抗

抗體分類:根據重鏈恒定區的血清學類型,可將抗體分為 IgM,IgG,IgA,IgD,IgE 五類,它們的重鏈分別為 mu, gamma, alpha, delta, epsilon 鏈。在上述每一類別中,按重鏈構造上的變異又可分為幾個亞類,例如人的 IgG 可分為 IgG1,IgG2,IgG3,IgG4 四個亞類。 輕鏈分為兩種類型,kappa鏈和lambda鏈,但每種抗體中只存在一種類型的輕鏈。 二抗:二抗是在其它宿主體內制備的能與一抗或一抗片段結合的抗體,上面通常連有酶或熒光素等標簽。由于二抗所具備的優點使得其在免疫學實驗中得以應用廣泛,如 western blot(通過與特異性抗體結合來鑒定蛋白質),ELISA(以耦聯有酶的抗體或抗原為標記來檢測特異性的蛋白質,尤其是相應的抗原或抗體),免疫組織化學(檢測組織中的特異性抗原),免疫細胞化學(通過免疫學方法檢測細胞的抗原組成),流式細胞術(通過檢測激光所激發熒光來鑒定分離不同類型的細胞)及免疫沉淀(通過抗原與抗體的特異性結合作用來分離相應抗原)。二抗針對某一特定物種(如小鼠)的所有抗體均具有特異性,因而使用標記的二抗可以免去對每一個一抗進行標記,大大節省了時間和費用;此外,一個一抗分子可以同時結合幾個二抗分子,從而使信號大大增強,提高了實驗靈敏度。

二,如何選擇二抗——根據一抗種屬及類型選擇合適的二抗

廣義上是指專門和進行特異性反應和結合的抗體,在免疫學反應中,經常需要針對試驗選擇不同的二抗,上海信帆生物科技有限公司為您的科研工作提供適合和全面的二抗產品。檢測任何目的靶蛋白都有不止一種抗體可供選擇,同時在后繼試驗中也會有不同的檢測方案,因此在選擇二抗的時候要綜合考慮一抗的類型及后繼檢測方案的要求,一般來說,選擇合適的二抗需要從下面幾個方面考慮:【一抗的種屬來源】

二抗應選用與使用的一抗相同的物種來源,例如:如果你的一抗是小鼠源的單克隆抗體,二抗則選抗小鼠的二抗(山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可);如果一抗是從兔血清里制備的兔源多克隆抗體,則相應的二抗需要選擇抗兔的二抗。即根據一抗的物種來源選擇相應的抗該物種的二抗。

二抗需與一抗的類別或亞類相匹配。這通常是針對單克隆抗體而言。多克隆抗體主要是IgG類免疫球蛋白,因此相應的二抗就是抗 IgG 抗體。其中單克隆抗體的類別及亞類通常會在產品說明書中都會有描述,如果你的一抗是小鼠 IgM,那么相應的二抗就應當是抗小鼠 IgM。如果單克隆一抗是小鼠 IgG 的某一亞類(IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3),那么幾乎所有的抗小鼠 IgG 都可以與之結合,或者你也可以選擇專門針對這一亞類的二抗,例如,如果你的一抗是小鼠 IgG1,那么你可以選擇抗IgG1 的二抗,此種抗體在雙標記實驗中尤其適合。在不清楚一抗為何種類/亞類的情況下,可以選用抗相應物種 IgG。

一般來說,不同的種屬來源與二抗的質量沒有必然的聯系,來源于山羊的二抗與來源于驢的二抗在一般的實驗里沒有太多的差別。然而在一些特殊的實驗里,如雙標實驗里,如果其中一個一抗是山羊來源的,一個是小鼠來源的,則相應的二抗分別要抗山羊和抗小鼠的二抗,這時候,二抗就不能選擇山羊或者小鼠來源的。有相應的驢來源的二抗,非常適合做類似雙標的免疫實驗?!径沟鸟盥摌擞洝?/p>

一般來講,耦聯到二抗上的探針主要有酶(辣根過氧化酶 HRP 和堿性磷酸酶 AP 或其衍生物,PAP),熒光基團(FITC、 Rhodamine、Texas Red、PE、Rhodamine、Dylight 等)金顆粒。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實驗。對于 Western Blot 和 ELISA,常用的二抗是酶標二抗;而細胞或組織標記實驗(細胞免疫化學,組織免疫化學,流式細胞術)中通常使用熒光基團標記的二抗,免疫組化中也可以使用辣根過氧化酶或堿性磷酸酶標記的二抗。如果想要更大程度的放大檢測信號,可以使用 Biotin/Avidin檢測系統。在一些熒光檢測方案中,則需要選擇不同的熒光標記;而金顆粒標記的二抗則更多的應用于免疫電鏡中。

Western Blot實驗應該如何選擇合適的抗體

 

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